다음 단계는 AlphaFold AI 기반 단백질 접힘 소프트웨어를 사용하여 CRISPR 복합체가 어떻게 상호 작용하는지 조사하는 것이었습니다. 업데이트된 버전은 단백질과 핵산뿐만 아니라 여러 단백질 복합체 간의 상호작용을 처리하도록 설계되었습니다. 그래서 팀은 가이드 RNA, Cas9 서열, 염기를 화학적으로 변형하고 Cas9에 달라붙을 수 있는 효소와 함께 표적 DNA 서열의 AlphaFold 버전을 공급했습니다.
불행히도, 그것은 질식하여 단백질 중 하나를 분명히 잘못된 위치에 배치했습니다.
이에 굴하지 않고 팀은 일을 단순화하고 AlphaFold에게 DNA, RNA 및 Cas9 단백질만 공급했습니다. 왜냐하면 후자가 서열 특이성을 결정하는 주요 요인이기 때문입니다. 이것은 훨씬 더 잘 작동하여 실제 핵산과 단백질을 사용한 실험을 통해 결정된 구조와 일치하는 구조를 생성했습니다.
연구자들은 서로 다른 표적 위치와 표적 위치를 벗어나는 부위에 먹이를 공급할 때 생성된 AlphaFold 구조를 비교함으로써 일반적인 패턴을 발견했습니다. 표적을 벗어난 부위의 대부분(약 2/3)은 Cas9 단백질이 약간 다른 구조를 채택하도록 했습니다. 그러나 거의 모든 것(95% 이상)이 RNA와 접촉하는 아미노산을 변경했습니다. 따라서 Cas9가 정상적인 구조를 유지하지만 그 내부의 아미노산이 표적을 벗어난 부위의 잘못된 염기를 수용하는 방식으로 구부러지는 경우가 분명히 있습니다.
편리하게도 AlphaFold는 “접촉 확률”, 즉 아미노산이나 뉴클레오티드와 같은 두 항목이 매우 작은 거리(8옹스트롬) 내에 있을 가능성을 식별하도록 이미 설정되어 있습니다. 연구자들은 표적 내 위치와 표적 외 위치에 대한 접촉 확률 분석 결과를 가져와 비교하여 가이드 RNA와 DNA 사이에 불일치가 있을 때 Cas9의 어떤 아미노산이 접촉을 변경했는지 정확하게 식별할 수 있습니다. 그들은 이 컴퓨터 분석 설정을 “ContactSeek”이라고 명명했습니다.
더 나은 타겟팅
자체적으로 ContactSeek는 표적을 벗어난 부위에 결합될 때 이동하는 많은 아미노산 목록을 생성하는 경향이 있었습니다. 그래서 연구자들은 이러한 아미노산이 모여 있는 Cas9 단백질 영역에 초점을 맞추었고, 이를 이러한 영역이 불일치 염기로 인한 차이에 적응하고 있다는 신호로 보았습니다. 그런 다음 그들은 이 사이트에서 다양한 아미노산을 사용하여 Cas9 버전을 테스트하기 시작했습니다.
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